“Reverse Purification" genomischer DNS

Die Aufreinigung von genomischer DNS ist eine essentielle Voraussetzung für ungezählte analytische Methoden in den Feldern „modern life science“ und Nukleinsäureforschung. Obwohl es eine Vielzahl etablierter Aufreinigungsmethoden gibt, kranken diese oft daran besonders arbeit- und zeitaufwändig zu sein. Hiermit informieren wir sie über ein neu entwickeltes chromatographisches Trennmaterial zur effektiven Aufreinigung von genomischer DNS auf Rohzellextrakten.

Methodik

Das Trennmaterial besteht aus speziellen Mikrokapseln, deren Wände eine definierte Porengröße aufweisen. Es wurde eine mit diesen Kapseln gefüllt Mikrosäule entwickelt, die es unter Ausnutzung des Prinzips der Größenausschlusschromatographie die genomische schnell und in einem Schritt von den Bestandteilen des Zelllysats abzutrennen.

Die ausgeschlossene Fraktion enthält dabei nur die genomische DNS und diese wird zuerst von der Säule eluiert, wohingegen die permeable Fraktion, die alle anderen Bestandteile des Extrakts enthält, welche ein geringeres Molekulargewicht haben (z.B. Proteine, Polysaccharide, Salze), auf der Säule verbleibt sobald der Elutionsschritt automatisch stoppt. Der Anschluss einer speziellen Konzentratorfaser am Säulenauslass ermöglicht zusätzlich, simultan zum Trennschritt die Sammlung und Aufkonzentrierung der reinen DNS.

Durch diese „reverse purification“ -Technologie wird das erwünschte Produkt, also die genomische DNS als erstes von der Säule gewonnen. Hierbei sind keine weiteren Schritte, wie Binden, Waschen, Lösen oder Precipitieren der DNS notwendig. Das Zellextrakt wird einfach auf die Säule aufgetragen, dann Elutionspuffer durch die Säule gesaugt und dabei wird die DNS in einem Schritt gereinigt, gesammelt und aufkonzentriert.

Anwendungen

Diese neue Aufreinigungsmethode kann bei der Isolation genomischer DNS aus einer Vielzahl biologischer Quellen eingesetzt werden. Im Rahmen der Entwicklungsarbeiten wurde genomische DNS erfolgreich aus Pflanzen (z.B. Arabidopsis thaliana, Zea mays, Triticum aestivum, Daucus carota, Rosa spec., Juglans regia, Quercus robur), tierischen und humanen Quellen (Schwanz, Leber und Niere von Maus und Schwein, HeLa-Zellsen, Humanblut) und Mikroorganismen (Saccharomyces cereviseae, Streptomyces spec., Anabena variabilis) aufgereinigt.

Für die Aufreinigung aus den unterschiedlichen Matrizes stehen verschiedene Kitvarianten mit für die Lyse und die Trennung optimierten Puffern zur Verfügung. Ein besonderer Vorteil dieser Technologie besteht darin, dass hiermit auch Probenmatrizes, die gemeinhin nur schwer mit gängigen Methoden aufzureinigen sind, da sie zum Beispiel hohe Gehalte an phenolischen Substanzens und Polysacchariden aufweisen, aufgereinigt werden können, ohne dass es weiterer Schritte bedarf. Selbst aus geringsten Probenmengen (z.B. 1 bis 25 mg Frischmasse) kann genügend DNS gewonnen werden, um Downstream-Analysen, wie z.B. PCR, Sequenzierung, Methylisationsanalyse, erfolgreich durchzuführen.

Vorteile

Die neue Methode ist effektiv, schnell, einfach und erbringt qualitative hochwertige genomische DNS. Die DNS ist direkt für PCR und andere “downstream” -Anwendungen einsetzbar. Die einfache Handhabung ermöglicht eine aufwandsarme Automatisierung der Technologie. Ein geringer Verbrauchsmittelkonsum, sowie das Auskommen ohne organische Lösungsmittel und andere gefährliche Substanzen klassifizieren diese neue Entwicklung als ein „green product“.